培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇
| n 概述 | ² 凍存過(guò)程 |
| n 冷凍保存與復(fù)蘇的原理 | ² 凍存結(jié)果 |
| ¨ 冷凍速率 | ² 討論 |
| ¨ 冷凍保存溫度 | n 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| ¨ 復(fù)溫速率 | ¨ 非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| ¨ 冷凍保護(hù)劑 | ² 主要材料 |
| n 冷凍保存方法 | ² 復(fù)蘇過(guò)程 |
| ¨ 非玻璃化凍存方法 | ² 結(jié)果 |
| ² 主要材料 | ² 討論 |
| ² 凍存過(guò)程 | ¨ 玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| ² 凍存結(jié)果 | ² 主要材料 |
| ² 討論 | ² 復(fù)蘇過(guò)程 |
| ¨ 玻璃化凍存方法 | ² 結(jié)果 |
| ² 主要材料 | ² 討論 |
n 概述
Spallanzani（1776）**早發(fā)表了冷“處理”對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人驚奇的現(xiàn)象，那些原本已經(jīng)不動(dòng)了的精子又“復(fù)活”了，就好象是剛從輸精管排出來(lái)的一樣，冷處理延長(zhǎng)**數(shù)十分鐘，情況依然如此。于是，他認(rèn)為冷不能殺死精子。大約100年以后，許多早期的學(xué)者重復(fù)了低溫處理對(duì)精子活動(dòng)的影響，同樣得出了相似的結(jié)論。到1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化學(xué)物質(zhì)）能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。
Shettles（1940）證明人類的精子也能抵抗溫度的突然變化，他將人的精液封閉在小管內(nèi)，在-790C～-1960C之間的低溫條件下進(jìn)行冷處理，發(fā)現(xiàn)有10%的精子仍然能夠存活。此后，冷凍處理研究材料的范圍大大拓展。
Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存的細(xì)胞具有保護(hù)作用，他們?nèi)匀灰跃舆M(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，加入甘油能夠大大提高貯存于-790C下精子的存活率。接下來(lái)的重大進(jìn)展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)貯存細(xì)胞的損傷作用。他們的結(jié)論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細(xì)胞損傷的主要原因。冷凍理論后來(lái)得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（1961）等學(xué)者的繼續(xù)和發(fā)展。
1949年**1960年這一段時(shí)間可以稱為冷凍保存的“甘油時(shí)期”，這一時(shí)期對(duì)生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護(hù)劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發(fā)展。目前，無(wú)論是冷凍保存理論、各種保護(hù)劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。
冷凍保存與復(fù)蘇原理
在低于-700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚**終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖?*超低溫，即可使生命活動(dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)**常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降**零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過(guò)程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)shou先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。
冷凍速率
冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷**-50C時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷**-5～-150C之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動(dòng)的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非常快（即超快速冷凍），則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無(wú)序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。
不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)慢時(shí)，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過(guò)一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過(guò)慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過(guò)快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及外滲，會(huì)形成較到冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對(duì)細(xì)胞存活來(lái)說(shuō)是**為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無(wú)冰晶形成或形成很小的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會(huì)在高濃度的溶質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間暴露而受損。
不同細(xì)胞的**適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的**適冷凍速率分別為1.60C/min、70C/min和2000C/min。細(xì)胞與細(xì)胞之間的**適冷凍速率可在1.60C～3000C/min，故對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，shou先需要測(cè)定其**適冷凍速率，以保證獲得**高的冷凍存活率。
冷凍保存溫度
冷凍保存溫度是指能長(zhǎng)期保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚**停止，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。
不同的細(xì)胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是 目前**佳的冷凍保存溫度。在-1960C時(shí)，細(xì)胞的生命活動(dòng)幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過(guò)程得當(dāng)，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C～-800C保存細(xì)胞，短期內(nèi)對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響，但隨著凍存時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-400C范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。
復(fù)蘇速率
冷凍保護(hù)體外培養(yǎng)物，除了必須有**佳的冷凍速率、合適的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時(shí)也必須有**佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證**后獲得**佳冷凍保存效果。
復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低凍存細(xì)胞存活率。一般來(lái)說(shuō)，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過(guò)慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時(shí)造成的細(xì)胞損傷非常快，往往在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。
冷凍保護(hù)劑
冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來(lái)講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中，并以**適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對(duì)于大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無(wú)**適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～600#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#0C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細(xì)胞會(huì)死亡；而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí)，98%以上的細(xì)胞都可存活。
冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免了細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大，而在40C時(shí)，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時(shí)DMSO平衡多在40C下進(jìn)行，一般需要40～60分鐘。
非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說(shuō)很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時(shí)，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。
不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。
冷凍保存方法
按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來(lái)劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫**-700C～-800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降**-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒(méi)有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存**常用的仍是前一種方法。
非玻璃化凍存方法
下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過(guò)程。
主要材料
（1）儀器設(shè)備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C～-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等；
（2）凍存管：容量為1ml或1.5ml；
（3）冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；
（4）待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。
操作過(guò)程
1. 待凍存細(xì)胞懸液的制備
(1) 按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；
(2) 將細(xì)胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜；
(3) 向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml；
(4) 按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；
(5) 再凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。
2. 分級(jí)冷凍
(1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min；
(2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C～-200C），約30～60min；
(3) 將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C），放置30min左右；
(4) 然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C～-800C），過(guò)夜；
(5) **后將凍存管投入液氮保存。
3. 記錄
做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。
凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。
討論
在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)**好帶手套。
在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。操作過(guò)程中**好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。
應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無(wú)微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37～400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。
玻璃化凍存方法
以下以人單核細(xì)胞為例說(shuō)明這種細(xì)胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）。
主要材料
（1）冷凍保護(hù)液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH**7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。
（2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內(nèi)徑3mm，外徑4.5mm；
（3）設(shè)備：液氮儲(chǔ)存罐；
（4）待凍存細(xì)胞：人類外周血單核細(xì)胞。
凍存過(guò)程
（1） 用常規(guī)方法分離全血中單核細(xì)胞；
（2） 在冰浴中預(yù)冷冷凍保護(hù)液；
（3） 將裝有單核細(xì)胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)（冰浴）；
（4） 沿離心管壁緩慢滴加預(yù)冷的冷凍保護(hù)液。滴加過(guò)程為：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的凍存液以0.75ml/min速度滴加。2×107個(gè)細(xì)胞要滴加15ml凍存液。滴加的時(shí)間在15min左右。**終細(xì)胞密度要在1×106～1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml，邊滴加邊輕輕晃動(dòng)離心管；
（5） 輕輕吹吸混勻細(xì)胞冷凍懸液；
（6） 將細(xì)胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm長(zhǎng)的凍存管裝0.8ml細(xì)胞冷凍懸液；
（7） 將凍存管兩端以火焰封口；
（8） **后將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為6000C/min。
凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。
討論
玻璃化凍存法對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。
因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對(duì)細(xì)胞具有毒性（但在40C時(shí)毒性大為減弱）。所以，冷凍保護(hù)液的滴加全過(guò)程必須在40C冰浴中進(jìn)行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過(guò)快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。
凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
¨ 非玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
主要材料
（1） 儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機(jī)；
（2） 培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。
復(fù)蘇過(guò)程
（1） 調(diào)配370C～400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)**370C～400C；
（2） 從液氮中取出凍存管，立即投入370C～400C 溫水中迅速晃動(dòng)，直**凍存液完全溶解；
（3） 將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；
（4） 將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜；
（5） 向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。
討論
細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)程中，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識(shí)，避免被液氮凍傷。
玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
以下以人的單核細(xì)胞為例說(shuō)明其過(guò)程（Takhashi et al. 1986）。
主要材料
（1）設(shè)備：高速離心機(jī)；
（2）培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。
操作過(guò)程
(1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約5600C/min。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇；
(2) 將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中；
(3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入，**后30min以1ml/min的速度加入。全過(guò)程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行；
(4) 將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用于培養(yǎng)。
結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
討論
復(fù)蘇時(shí)，冷凍保護(hù)液的稀釋及去除過(guò)程與凍存前冷凍保護(hù)液的滴加過(guò)程一樣，不能在室溫下而必須在40C冰浴中進(jìn)行，避免在室溫下冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。稀釋過(guò)程也要緩慢進(jìn)行，保證有足夠的時(shí)間讓冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)滲出，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。
